ブログ

Feb 20, 2024

メニスカス効果を補償する適応型位相差顕微鏡法

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5785 (2023) この記事を引用 1049 アクセス 1 オルトメトリック メトリクスの詳細 この記事は更新されました 位相コントラストは最も重要な要素の 1 つです

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5785 (2023) この記事を引用

1049 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この記事は更新されました

位相コントラストは、染色されていない透明な細胞を可視化するための最も重要な顕微鏡法の 1 つです。 細胞培養は、いくつかの円筒形ウェルからなるマイクロタイター プレートで培養されることがよくあります。 培地の表面張力によりウェル内に液体レンズが形成され、より湾曲したエッジ領域では位相コントラスト条件が崩れ、細胞の観察が妨げられます。 適応型位相差顕微鏡法は、メニスカス効果を光学的に補償することにより、観察可能な領域を大幅に拡大する方法です。 顕微鏡のコンデンサー環は透過型 LCD に置き換えられ、動的な変化が可能になります。 変形可能な液体で満たされたプリズムが照明経路に配置されます。 プリズムの表面角度は、液体レンズの接線角を補償できるように、透過光を屈折させるように適応的に傾けられます。 位相コントラスト画像の観察に加えて、ビームスプリッターによりコンデンサー環と位相リングの変位を同時に観察することができます。 アルゴリズムによって変位が分析され、LCD とプリズムが動的に調整され、位相コントラストの状態が保証されます。 実験では、特に小さなウェルサイズの場合、観察可能な領域が大幅に増加することが示されています。 96 ウェル プレートの場合、標準的な位相差顕微鏡の代わりに、位相差条件下で 12 倍を超える面積を検査できます。

1932 年に Frits Zernike によって最初に提案された位相差顕微鏡法 1 は、染色されていない透明な細胞を可視化できるため、生体サンプルを観察するために広く使用されている方法です 2。 干渉により、通過する光の位相シフトが可視化され、半透明のオブジェクトのコントラストが向上します。

ただし、その用途はメニスカス効果によって制限され、特に 96 ウェル以上のマイクロプレート内のサンプルに影響を及ぼします 3。 参考測定によると、6 ウェル プレートでは、ウェル表面積の 25% (950 mm2 のうち 235 mm2) で位相コントラスト状態が見られることが示されています。 96 ウェル プレートでは、わずか 2.3% (36.3 mm2 の 0.84 mm2)4 です。

位相コントラストは、照明ビーム経路に集光環が配置され、対物レンズ内の光が位相リングを介して導かれる透過光顕微鏡法です (図 1 を参照)。 コンデンサー環像と位相リングが重なると、位相コントラスト状態が発生します。 位相シフトは、光学的に強調表示される細胞境界など、観察された標本の遷移部分で発生します。 位相コントラストの状態は、「ハロー」効果によって簡単に識別できます。これは、背景が暗く、位相が変化するオブジェクトの周囲にエッジが明るい領域です 2,6。

異なるウェル位置での位相差顕微鏡の照明経路の概略図。 (A) 顕微鏡を通る簡略化された光路 (偏向ミラーやガラス プレートなどの非アクティブな要素は省略されています)。 (1) 光源 (2) 集光環 (3) 集光レンズ (5) MTP (6) 対物レンズ (7) 位相リング (8) 可動ミラー (9) ベルトランレンズ (10) 接眼レンズ (11) 副カメラ ( 12) チューブレンズ (13) メインカメラ。 ミラー (8) を動かすことにより、主光路 (I) と副光路 (II) を切り替えて、位相リングと集光環の重なりを観察することができます。 (B) 光はウェルの中心を通過します。 (B.1) 位相リングとコンデンサー環の重ね合わせ画像。 それらは完全に重なっています。 (B.2) 得られた細胞培養の位相コントラスト画像。 (C) ウェルの端に向かう表面の曲率により、光線は中心から離れる方向に屈折します。 (C.1) 重ね合わせ画像では、コンデンサー環 (2) と位相リング (7) の間のずれが見えます。 (C.2) したがって、得られる細胞画像は明視野条件下で撮影されます。 画像 (A.2) および (B.2) は、6 ウェル MTP で 10 倍の対物レンズ (Nikon CFI Plan Fluor DL 10XF) を使用して撮影されました。