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Sep 29, 2023

ティルトミラーアセンブリを使用した調整可能な周波数照明を備えた透過型構造照明顕微鏡

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1453 (2023) この記事を引用 2076 アクセス 4 オルトメトリクスの詳細 チルトミラー支援伝送の実験デモンストレーションを紹介します

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1453 (2023) この記事を引用

2076 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

我々は、広い視野の超解像イメージングを提供するチルトミラー支援透過型構造照明顕微鏡（tSIM）の実験的デモンストレーションを紹介します。 カスタム設計のチルトミラーのアセンブリが照明モジュールとして採用されており、対向するミラーファセットのペアから反射される 2 つのビームの干渉によってサンプルが励起されます。 調整可能な周波数構造パターンはミラーの傾斜角を変更することによって生成され、六角形の対称配置は 3 つの方向における等方性の解像度を考慮しています。 標準 SIM で高開口数 (NA) 対物レンズを利用することで、視野 (FOV) を犠牲にして超解像を実現します。 低 NA (20X/0.4) の対物レンズ検出を使用して、\(\sim\)1.7- および \(\ を使用して \(\sim\) (0.56 mm\(\times\)0.35 mm) サイズの単一 FOV 画像を実験的に実証します。 sim\)回折限界を超えて 2.4 倍の解像度の向上 (チルトミラーを調整することでさまざまな照明を活用)。 結果は、蛍光ビーズと生物学的サンプルの両方について検証されます。 tSIM ジオメトリは、照明光路と集光光路を分離するため、チルトミラーによって定義される照明パターンの空間周波数に影響を与えることなく、結像対物レンズを自由に変更できるようになります。 tSIM によってサポートされる大きくてスケーラブルな FOV は、病理学などの広い領域のスキャンが必要なアプリケーションや、画像を空間と時間の両方で相関させる必要があるアプリケーションに使用されます。

過去 20 年間で古典的な蛍光顕微鏡の回折限界 1,2 を突破したことにより、生物医学研究に革命が起こり、「光学ナノスコピー」と呼ばれる新しい研究分野が誕生しました 3,4。 急速に進歩しているナノスコピーの分野では、構造化照明顕微鏡 (SIM)5、6、7 が重要な広視野超解像技術として登場しています。この技術では、一連の構造化パターンを使用して蛍光サンプルを励起し、対応する生のモアレ フレームが計算処理されて、広視野限界を超えて約 2 倍の解像度向上を達成します。 誘導放出除去 (STED)、確率的光再構成顕微鏡 (STORM)、10、11 光活性化局在化顕微鏡 (PALM) などの他の光学超解像技術と比較して、比較的適度な解像度の向上を提供しているにもかかわらず、 SIM は、その高い時空間分解能、低い光毒性、一般的な蛍光標識との適合性、効率的なマルチカラーイメージング 16,17 などにより、かなりの注目を集めています。 また、生のフレーム数が少なく、光子線量が少ないため、生細胞の細胞内ダイナミクスを研究するための有望なアプローチとも考えられています 18,19。 正弦波構造の励起パターンは、SIM を通じて優れた解像度のイメージングを実現するための重要な機能ですが、周期的な照明パターンに限定されなくなりました。 ブラインド再構成アプローチによるスペックル状ランダム照明 20,21 も SIM イメージングにうまく実装されています。 ただし、ランダム照明法では、多数のフレーム (\(\sim\)100s) が必要となるため、時間解像度が低くなりますが、超解像度が得られます。 これらの方法は、2D(3D) SIM の場合に必要なフレーム数 9(15) を最小限に抑え、最近報告された特定のケースではさらに少なくなる、周期的構造化照明イメージングの主要なテーマを一掃します。 したがって、明確に定義された周期的な照明パターンを維持することで SIM の解像度をさらに向上させる努力は価値があります。

従来のリニア SIM 技術では、サンプルの照明と蛍光信号の収集に 1 つの対物レンズが使用されます。 その結果、照明光学系と検出光学系の両方が同じ対物レンズによって回折限界となり、システムは古典的な回折限界と比較して \(\le\) 2 倍の解像度向上を提供するように厳しく制限されます。 一般的な SIM 解像度の限界をさらに超えるために、エバネッセント波の高周波干渉パターンがサンプルを照射する全内部反射蛍光 (TIRF)-SIM24、25 があります。 ただし、TIRF 照明は薄い光学セクション (<100 nm) に制限されているため、2D イメージングのみを扱います。 さらに、蛍光物質の飽和特性は、超解像度イメージングにおける複数の高調波の寄与を組み込んだ非線形 SIM26、27、28 アプローチで利用されます。 ただし、蛍光色素分子の動作飽和レベルに達するには高強度が必要であるため、非線形アプローチでは光毒性の問題が発生する可能性があります。 さらに、プラズモニック 29、30、近接投影回折格子 31、またはフォトニック チップ 32 など、さまざまな原理に基づく SIM 技術も報告されています。 これらの各技術は、サンプル面内の構造化された照明パターンを操作するために、洗練された専用のフォトニックまたはプラズモニック材料を必要とします。 さらに、位相シフトやパターンの向きの変更には、フォトニック チップ SIM の熱光学やプラズモニック SIM のガルバノ スキャンなど、特別に設計されたツールが必要です。 一般に、これらの技術は専用のマテリアルに依存しているため複雑です。 これにより、照明パターン周波数の調整可能性が制限されます。 プラズモニック SIM では、事前に校正されたアレイ構造が動作波長範囲に従って製造されます。 特定の構造により、照明パターンの方向と周波数が選択的に決定され、パターンの調整はできません。 同様に、フォトニック チップ SIM では、照明パターンの周波数は利用可能な導波路アームの角度によって事前に決定されます。 最後に、顕微鏡スライドまたはカバースリップ上の従来のサンプルは、これらの方法では機能しません。 エバネッセント領域の定在波干渉パターンによって照明される設計材料の表面上にサンプルを準備する必要があるため、これらの技術は 2D-TIRF 超解像に限定されます。